Wspomagając młodych naukowców w ich pracy w labie, redakcja biostrefa.net przygotowała kilka wskazówek merytorycznych dotyczących izolowania i oczyszczania białek.
Wskazówki dotyczące izolacji i oczyszczania białek
Duża liczba białek jest wrażliwa na degradację (peptydazy komórkowe), dlatego izolację prowadzi się często wobec inhibitora peptydaz- PMSF oraz
niskiej temperatury.
Produkcja białek rekombinowanych
Produkcja
dużych ilości białek rekombinowanych wymaga konstrukcji wektorów
ekspresyjnych niosących jako wstawkę cDNA interesującego nas
białka, z dołączonym znacznikiem, który umożliwa wydajną izolację
metodami tzw. chromatograficznego powinowactwa.
ekspresyjnych niosących jako wstawkę cDNA interesującego nas
białka, z dołączonym znacznikiem, który umożliwa wydajną izolację
metodami tzw. chromatograficznego powinowactwa.
Niestety, brak jest uniwersalnych metod oczyszczania wszystkich białek.
Etapy izolacji i oczyszczania białek związanych z chromatyną
Etapy izolacji i oczyszczania białek związanych z chromatyną:
- Izolacja chromatyny z wybranej tkanki.
- Ekstrakcja białek związanych z chromatyną (zależnie od właściwości białek, dla słabiej związanych 0,3 M NaCl, dla tych związanych silniej 0,6-2 M NaCl).
- Rozpuszczenie mieszaniny białek w TCA.
- Oczyszczenie przy użyciu chromatografii jonowymiennej na kolumnach (Sephadex C-25).
Techniki analizy i puryfikacji białek
Techniki
analizy i puryfikacji białek:
- Elektroforeza żelowa jednokierunkowa – stopień usieciowania żelu umożliwia
frakcjonowanie białek wg ich rozmiaru (masy). Mieszanina białek
rozpuszczona w detergentach (np. SDS, który nadaje ładunek), z dodatkiem ME,
DTT (niszczą mostki S-S). - Elektroforeza dwukierunkowa, 2DE – rozdzielenie białek względem masy oraz punktu izoelektrycznego.
- Chromatografia
-
Filtracja
żelowa (sączenie molekularne) -
Jonowymienne
-
Powinowactwa
4. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (sacharozy)
5. Spektroskopia masowa
Techniki chromatograficzne
Techniki
chromatograficzne:
- Filtracja
żelowa – kolumny z
Sephadex, Sepharose. Małe białka wnikają do środka ziaren złoża
i zatrzymują się na kolumnie, duże przepływają. - Jonowymienna – wykorzystuje powinowactwo białek wobec złoża (jego wypadkowy
ładunek elektryczny jest inny dla każdego białka).
Kolumny w chromatografii
Kolumny:
Dodatnio
naładowane złoże (DEAE-celuloza) wyłapuje białka obdarzone „-„
naładowane złoże (DEAE-celuloza) wyłapuje białka obdarzone „-„
Ujemnie
naładowane złoże (CM-celuloza) wyłapuje białka „+”
naładowane złoże (CM-celuloza) wyłapuje białka „+”
Powinowactwa białek
3. Powinowactwa:
a)
Kowalencyjne przyłączenie grupy X (np. glukoza)
Kowalencyjne przyłączenie grupy X (np. glukoza)
b)
Nałożenie mieszaniny białek na kolumnę
Nałożenie mieszaniny białek na kolumnę
c)
Przemycie buforem (ma za zadanie usunąć białka niezwiązane)
Przemycie buforem (ma za zadanie usunąć białka niezwiązane)
d)
Elucja białek związanych
Elucja białek związanych
Np. konkanawalina – roślinne białko, które wiąże się z glukozą (większość
innych białek nie wykazuje powinowactwa do glukozy i przepływa
przez kolumnę). Konkanawalina
uwalniana jest z kolumny poprzez przepłukanie stężonym roztworem glukozy.
innych białek nie wykazuje powinowactwa do glukozy i przepływa
przez kolumnę). Konkanawalina
uwalniana jest z kolumny poprzez przepłukanie stężonym roztworem glukozy.
Ultrawirowanie w gradiencie gęstości
Ultrawirowanie
w gradiencie gęstości sacharozy:
Metoda ta wykorzystuje współczynnik sedymentacji [S], który jest charakterystyczny dla poszczególnych
białek. Białka
podczas wirowania przemieszczają się zgodnie z gradientem, ale zależnie
od charakterystycznych dla siebie współczynników sedymentacji. Metoda ta zależna jest od masy białka, jego formy przestrzennej, kształtu, a także gęstości.
białek. Białka
podczas wirowania przemieszczają się zgodnie z gradientem, ale zależnie
od charakterystycznych dla siebie współczynników sedymentacji. Metoda ta zależna jest od masy białka, jego formy przestrzennej, kształtu, a także gęstości.
Opracowanie: K.T.
Photos Selected by freepik